کاهش فعالیت ژن‌های ترمیم عدم‌تطابق، رشد تکرار هانتینگتون را در نورون‌های انسانی کند می‌کند

دانشمندان از سلول‌های یک فرد مبتلا به بیماری هانتینگتون (HD) استفاده کردند تا بررسی کنند آیا پایین آوردن سطح ژن‌های ترمیم DNA می‌تواند رشد تکرار بدنام CAG را کند کند یا نه. در این سلول‌های انسانیِ پرورش‌یافته در آزمایشگاه، تکرار واقعاً آهسته‌تر رشد کرد؛ موضوعی که یک راهبرد درمانی بالقوه را برای احتمالاً به‌تعویق انداختن شروع و پیشرفت بیماری پیشنهاد می‌کند، هرچند این کار هنوز در مرحله‌ای اولیه است.

چرا گسترش تکرارهای CAG در HD اهمیت دارد

HD به‌علت کشیدگیِ غیرطبیعیِ سه حرف DNA یعنی CAG در ژن هانتینگتین ایجاد می‌شود که اغلب به‌صورت HTT کوتاه می‌شود. به‌طور کلی، افزایش طول تکرارِ گسترش‌یافته CAG با بروز زودتر علائم HD و پیشرفت سریع‌تر بیماری مرتبط است.

اکنون می‌دانیم که برای افراد مبتلا به HD، طول CAG که فرد به ارث برده، تا پایان عمر ثابت نیست. در برخی سلول‌ها، به‌ویژه در ناحیه‌ای از مغز که تقریباً در میانه سر قرار دارد و «استریاتوم» نامیده می‌شود، تکرار CAG می‌تواند طی سال‌های طولانی به‌آرامی بلندتر شود. به این فرایند «گسترش سوماتیک» گفته می‌شود؛ یعنی گسترش تکرار CAG در سلول‌های «سوماتیک» یا سلول‌های بدن.

شواهد حاصل از بافت مغز انسان و حیواناتی که مدل HD هستند نشان می‌دهد این رشد اضافی (گسترش سوماتیک) عامل مهمی در آسیب‌پذیری این نورون‌هاست و یکی از عوامل اصلی پیش‌برندهٔ پیشرفت بیماری به شمار می‌آید.

ترمیم DNA: محرک کلیدی گسترش CAG

DNA ما دائماً بر اثر عواملی مانند تابش UV خورشید، آلاینده‌های محیطی و استرس داخل سلول‌ها آسیب می‌بیند. اما سلول‌ها همیشه در حال ترمیم این آسیب در DNA هستند. یکی از سامانه‌های حیاتی که مسئول حفظ یکپارچگی ماده ژنتیکی است «ترمیم عدم‌تطابق» (Mismatch Repair یا MMR) نام دارد. این سامانه مانند یک ویراستار مولکولی عمل می‌کند و خطاهای کوچک را پیدا کرده و اصلاح می‌کند تا یکپارچگی ژنتیکی حفظ شود.

با این حال، توالی بسیار تکراری CAG در ژن HTT از نظر ساختاری ناپایدار است و می‌تواند شکل‌های غیرمعمولی مانند حلقه‌های DNA ایجاد کند. وقتی اجزای سامانه MMR با این ساختارهای عجیب روبه‌رو می‌شوند، تصور می‌شود فرایند ترمیم کُد حروف DNA را اشتباه می‌خواند؛ چیزی شبیه به این‌که سامانه ویرایش، غلط‌های تایپی را بپذیرد.

این خطاهای ویرایشیِ سامانه MMR می‌تواند به وارد شدن تکرارهای اضافی منجر شود. در این زمینه، سامانه MMR که معمولاً از کُد ژنتیکی محافظت می‌کند، ناخواسته به یکی از سازوکارهای اصلیِ پیش‌برندهٔ گسترش زیان‌بار تکرار CAG تبدیل می‌شود.

این نقش مخرب MMR در مشارکت در HD به‌طور قوی با پژوهش‌های دیرینه پشتیبانی می‌شود. مطالعات ژنتیکیِ بزرگ‌مقیاس که «مطالعات همبستگی در سراسر ژنوم» (GWAS) نام دارند، در افراد مبتلا به HD این ارتباط را تأیید کردند؛ با شناسایی تفاوت‌های ژنتیکی طبیعی (واریانت‌ها) در چندین ژن مرتبط با MMR که سن شروع علائم را تغییر می‌دهند.

این یافته‌ها راهبردهای درمانی قانع‌کننده‌ای را مطرح کردند. اگر بتوانیم با ایمنی کافی فعالیت یا سطح برخی ژن‌های مشخص MMR را کاهش دهیم، شاید بتوانیم این فرایند گسترش را از سرچشمه به‌طور مؤثر کند کنیم.

بررسی ترمیم عدم‌تطابق در نورون‌های انسانیِ HD

بیشتر پژوهش‌های پیشین درباره ترمیم عدم‌تطابق و گسترش CAG از موش‌های مدل HD یا سلول‌های حیوانیِ پرورش‌یافته در ظرف آزمایشگاهی استفاده می‌کردند. در مطالعه‌ای تازه به رهبری دکتر سارا تبریزی از کالج دانشگاهی لندن، پژوهشگران از سامانه‌ای استفاده کردند که ارتباط مستقیم‌تری با انسان دارد.

آن‌ها کار را با سلول‌های پوستیِ اهدایی از یک دختر هفت‌ساله مبتلا به HD با شروع نوجوانی آغاز کردند که در ژن HTT یک تکرار CAG گسترش‌یافته بسیار بزرگ، بیش از ۱۲۵، داشت. دانشمندان مولکول‌هایی افزودند که سلول‌های پوستی را ترغیب می‌کرد به سلول‌های بنیادی تبدیل شوند؛ سلول‌هایی که توان خودنوسازی دارند و می‌توان آن‌ها را هدایت کرد تا به انواع مختلف سلول‌ها، از جمله سلول‌های مغزی، تبدیل شوند.

با استفاده از پروتکل‌هایی که در زمان‌های مختلف مواد شیمیایی متفاوتی اضافه می‌کنند، تیم سلول‌های بنیادی HD را به سلول‌های مغزیِ غنی از نورون‌های خاردار متوسط (MSN) تبدیل کرد؛ نورون‌هایی که در استریاتوم یافت می‌شوند، ناحیه‌ای مرکزی از مغز که به‌شدت تحت تأثیر HD قرار می‌گیرد. MSNها سلول‌های مغزیِ مشخصی هستند که می‌دانیم در HD به‌ویژه در برابر تخریب آسیب‌پذیرند. پژوهشگران به‌طور پیوسته طول تکرار CAG را هم در سلول‌های بنیادیِ در حال تقسیم و هم در این کشت‌های سلول مغزی اندازه‌گیری کردند تا ببینند طول تکرار در گذر زمان چگونه تغییر می‌کند.

استفاده از یک کلید دیمر مولکولی

برای آزمودن نقش ترمیم عدم‌تطابق، آن‌ها از ابزار ژنتیکی قدرتمندی به نام «تداخل CRISPR» (CRISPRi) استفاده کردند. CRISPRi مانند یک سامانه مولکولی عمل می‌کند که فعالیت ژن‌ها را با دقت، هر بار در یک ژن، کاهش می‌دهد. این سامانه با ویرایش ژن استاندارد متفاوت است، چون DNA را نمی‌بُرد. در عوض، از مولکولی استفاده می‌کند که می‌توانید آن را مانند قیچی مولکولی در نظر بگیرید و Cas9 نام دارد؛ مولکولی که در سطح مولکولی به یک «دیمر» متصل شده و سطح پروتئین هدف را به‌طور مؤثر پایین می‌آورد.

تیم از CRISPRi برای کاهش فعالیت ژن‌های ترمیم عدم‌تطابقی استفاده کرد که در مطالعات ژنتیکی انسانی (GWAS) شناسایی شده بودند. آن‌ها همچنین شرکای آن ژن‌های MMR را هدف گرفتند. ژن‌های هدف شامل اجزایی از خانواده‌های کمپلکس‌های چندپروتئینی بود: خانواده MutS (MSH2، MSH3، MSH6) و خانواده MutL (MLH1، PMS1، PMS2، MLH3)، به‌همراه آنزیم DNA لیگاز ۱ (LIG1).

هدف مطالعه این بود که فعالیت آن‌ها تا سطوحی کاهش یابد که با داروهای درمانی واقع‌بینانه قابل دستیابی باشد، نه این‌که ژن‌ها به‌طور کامل حذف شوند. این رویکرد به آن‌ها اجازه داد واقع‌بینانه‌تر شبیه‌سازی کنند که چه چیزی می‌تواند به‌عنوان درمان توسعه یابد یا آن واریانت‌هایی را تقلید کنند که به‌طور طبیعی در برخی افراد مبتلا به HD با شروع دیرتر علائم دیده می‌شود.

سپس پژوهشگران بررسی کردند که آزمایش‌هایشان موفق بوده است یا نه؛ بنابراین آزمایش دیگری به نام «آزمون نقص MMR» انجام دادند. این کار به آن‌ها امکان داد تأیید کنند که واقعاً فعالیت ژن‌های هدف MMR را پایین آورده‌اند. برای این منظور، سلول‌ها را با ماده‌ای شیمیایی تیمار کردند که آسیب DNA را تقلید می‌کند. در سلول‌هایی که سامانه MMR کاملاً کارآمد دارند، این ماده معمولاً مرگ سلولی را تحریک می‌کند. اما اگر عملکرد MMR مختل شود، سلول‌ها می‌توانند زنده بمانند.

این آزمایش تأیید کرد که سامانه MMR در سلول‌های دستکاری‌شده تضعیف شده است و در مقایسه با گروه کنترل، بقای سلولی افزایش یافته بود. مهم‌تر این‌که کاهش عملکرد کامل نبود؛ موضوعی که با هدف کاهش جزئی هم‌راستا بود و به پژوهشگران سامانه‌ای داد که در آن می‌توانند سطح این ژن‌ها را به‌صورت مولکولی «کم‌نور» کنند؛ یعنی آن‌ها را پایین بیاورند، نه این‌که کاملاً خاموش کنند.

اثر کم‌کردن فعالیت ژن‌های MMR بر گسترش‌های CAG

در نهایت، آن‌ها نرخ گسترش تکرار CAG را هم در سلول‌های بنیادیِ در حال تقسیم و هم در نورون‌های تخصصیِ استریاتومی بررسی کردند و نرخ‌های گسترش را با و بدون کاهش فعالیت ژن‌های ترمیم عدم‌تطابق مقایسه کردند.

در سلول‌های بنیادی HD، تکرار CAG به‌طور معمول با گذر زمان بلندتر می‌شد که قابل انتظار بود. اما وقتی چندین ژن ترمیم عدم‌تطابق با CRISPRi پایین آورده شدند، این رشد کند شد؛ یعنی نظریه تیم درست بود. قوی‌ترین اثرات کندکننده زمانی دیده شد که تیم اجزای اصلی MutS (MSH2 و MSH3) و جزء مرکزی MutL (MLH1) را کاهش داد. پایین آوردن این ژن‌ها نرخ گسترش را در سلول‌های بنیادیِ در حال تقسیم بین ۶۰٪ تا ۶۵٪ کاهش داد و سایر عوامل MutL (PMS1، PMS2 و MLH3) نرخ را ۲۵ تا ۳۵٪ کم کردند.

مهم‌تر از همه، الگوهای مشابهی در کشت‌های سلول مغزی ساخته‌شده از همان سلول‌های بنیادی HD دیده شد. پژوهشگران به‌طور راهبردی در نورون‌ها بر عوامل MutL (PMS1، PMS2 و MLH3) تمرکز کردند، زیرا آزمایش‌های پیشین در سلول‌های بنیادی، MSH6 و LIG1 را کنار گذاشته بود و MSH2 به دلیل خطر سرطان نگرانی‌های بالقوه ایمنی ایجاد می‌کرد. همچنین درباره MSH3 عمیقاً بررسی نکردند، چون در جای دیگری به‌طور فعال به‌عنوان هدف درمانی دنبال می‌شود.

در نورون‌ها، با پایین آوردن MLH1، این گسترش ۶۹٪ کند شد و هدف‌گیری PMS1، PMS2 یا MLH3 نیز گسترش را در مقایسه با سلول‌های کنترل بیش از ۲۰٪ کند کرد. این نشان می‌دهد که ترمیم عدم‌تطابق همچنان محرک کلیدی گسترش سوماتیک در نورون‌های انسانیِ HD است، نه فقط در سلول‌های بنیادیِ در حال تقسیم یا در موش‌ها. افزون بر این، نشان می‌دهد که با تنظیم سطح این ژن‌های مشخص MMR، پژوهشگران شاید بتوانند گسترش سوماتیک را به‌طور معناداری کند کنند. چشم‌اندازی بسیار هیجان‌انگیز!

این مطالعه چه چیزی را نشان داد و چه چیزی را نشان نمی‌دهد

به زبان ساده، پیام اصلی این پژوهش این است: در نورون‌های انسانیِ پرورش‌یافته در ظرف آزمایشگاهی که از فردی مبتلا به HD ساخته شده بودند، پایین آوردن ژن‌های ترمیم عدم‌تطابق ظاهراً برای کند کردن رشد تکرار زیان‌بار CAG کافی است.

این کار برای ایده درمان‌های «ضد گسترش» دلگرم‌کننده است. در عین حال، مهم است روشن باشد که این مطالعه چه چیزی را نشان نمی‌دهد. همه کارها در سلول‌های داخل ظرف انجام شد، نه در مغز زنده. فقط از یک رده سلول بنیادی HD با شروع نوجوانی، با تکراری بسیار طولانی، استفاده شد.

این مطالعه طول تکرار CAG و توزیع آن را اندازه‌گیری کرد. بقای نورون‌ها، رفتار یا عملکرد مغز را آزمایش نکرد. همچنین به ایمنی بلندمدت نپرداخت. ژن‌های ترمیم عدم‌تطابق به محافظت از همه بافت‌ها در برابر سرطان کمک می‌کنند و تغییر فعالیت آن‌ها در انسان خطر ایجاد سرطان را به همراه دارد؛ به‌ویژه چون از دست رفتن ژن‌هایی مانند MSH2 و MLH1 با افزایش چشمگیر خطر سرطان‌های دستگاه عصبی مرتبط است و PMS2 نیز تا حدی خطر را افزایش می‌دهد.

آنچه این کار فراهم می‌کند، فهرست کوتاه واقع‌بینانه‌تری از ژن‌های ترمیم عدم‌تطابق است که در زمینه HD انسانی امیدوارکننده به نظر می‌رسند و اعضای خانواده MutL، به‌ویژه PMS1، را به‌عنوان اهداف بالقوه برجسته می‌کند. این مطالعه از این ایده پشتیبانی می‌کند که کاهش محتاطانه فعالیت ژن‌های منتخب ترمیم عدم‌تطابق—احتمالاً به‌صورت متوسط و شاید به‌صورت ترکیبی—می‌تواند راه ارزشمندی برای کند کردن گسترش CAG باشد. این اطلاعات می‌تواند به هدایت طراحی و اولویت‌بندی درمان‌های آینده کمک کند؛ درمان‌هایی که هدفشان فقط درمان علائم نیست، بلکه تغییر سرعت خودِ بیماری هانتینگتون است.

خلاصه

• ترمیم عدم‌تطابق محرک گسترش CAG در نورون‌های انسانی است: با استفاده از سلول‌های مغزی ساخته‌شده از یک فرد مبتلا به HD که در ظرف آزمایشگاهی رشد داده شده بودند، پژوهشگران تأیید کردند که سامانه ترمیم عدم‌تطابق محرک رشد تکرار CAG در نورون‌های انسانی است، نه فقط در موش‌ها یا سلول‌های در حال تقسیم.
• پایین آوردن ژن‌های ترمیم، گسترش را کند کرد: با کاهش جزئی فعالیت ژن‌های مشخص ترمیم عدم‌تطابق، تیم رشد تکرار CAG را در نورون‌ها تا ۶۹٪ کند کرد و اعضای خانواده MutL، به‌ویژه PMS1، به‌عنوان اهداف درمانی بالقوه مطرح شدند.
• یافته‌های ژنتیکی اکنون در سلول‌های انسانی پشتوانه تجربی دارند: مطالعات ژنتیکی بزرگ پیش‌تر به ژن‌های ترمیم عدم‌تطابق به‌عنوان تعدیل‌کننده‌های زمان شروع HD اشاره کرده بودند. این مطالعه نقش آن‌ها را در نورون‌های انسانیِ پرورش‌یافته در ظرف آزمایشگاهی تأیید می‌کند و کمک می‌کند مشخص شود کدام ژن‌ها باید هدف قرار گیرند. این کار در یک رده سلولیِ واحد و در ظرف انجام شد، اما گامی مهم به سوی درمان‌هایی است که هدفشان کند کردن گسترش CAG است.