صید یک پروتئین غول‌پیکر: پنج روش جدید برای به دام انداختن هانتینگتین

بیماری هانتینگتون (HD) ناشی از تغییر در یک ژن واحد به نام هانتینگتین است. این ژن حاوی دستورالعمل‌هایی برای ساخت پروتئین هانتینگتینپروتئین هانتینگتین پروتئین تولید شده توسط ژن هانتینگتون است. با وجود گذشت بیش از سه دهه از کشف ژن HD، دانشمندان همچنان در تلاشند تا دقیقاً بفهمند پروتئین هانتینگتینپروتئین هانتینگتین پروتئین تولید شده توسط ژن هانتینگتون در سلول‌های سالم چه کاری انجام می‌دهد و چگونه نسخه HD باعث بیماری می‌شود.

یکی از دلایلی که پیشرفت بسیار کند بوده این است که مطالعه هانتینگتین واقعاً دشوار است. این پروتئین بسیار بزرگ است، به روش‌های پیچیده‌ای تا خورده است، و ابزارهایی که دانشمندان در اختیار داشتند برای به دام انداختن آن چندان خوب نبودند. در یک مطالعه جدید، تیمی از کانادا و ژاپن ابزارهای شیمیایی کاملاً جدیدی ساختند: حلقه‌های کوچک پروتئینی به نام ماکروسیکل که می‌توانند هانتینگتین را در پنج نقطه مختلف به دام بیندازند. پس آنها چه چیزی ساختند، چه چیزی آموختند و چرا این موضوع برای HD اهمیت دارد؟

پروتئینی غول‌پیکر که دیدنش دشوار است

برای درک چالش، تصور هانتینگتین کمک می‌کند. اگر بیشتر پروتئین‌ها مانند لوازم خانگی معمولی با یک وظیفه واحد باشند، هانتینگتین بیشتر شبیه یک آشپزخانه کامل است – ساخته شده برای پشتیبانی از چندین کار مختلف به طور همزمان.

این یک زنجیره بسیار بلند است که به دو توده بزرگ متصل به یک پل خمیده تا می‌شود. تغییر ژنتیکی که باعث HD می‌شود، در همان ابتدای پروتئین هانتینگتینپروتئین هانتینگتین پروتئین تولید شده توسط ژن هانتینگتون قرار دارد، جایی که یک بخش تکراری کوتاه (ساخته شده از یک واحد سازنده به نام گلوتامینگلوتامین بلوک ساختمانی اسید آمینه ای که در ابتدای پروتئین هانتینگتین جهش یافته بارها تکرار می شود) به طور غیرطبیعی گسترش می‌یابد. افراد معمولاً حدود ۲۰ تا ۳۵ عدد از این گلوتامینگلوتامین بلوک ساختمانی اسید آمینه ای که در ابتدای پروتئین هانتینگتین جهش یافته بارها تکرار می شود‌ها را دارند؛ در HD، این تعداد از ۳۵ فراتر رفته و می‌تواند به ۵۰، ۸۰ یا بیشتر برسد.

هانتینگتین وظایف زیادی در بدن دارد. این پروتئین به جابجایی مواد در داخل سلول‌ها کمک می‌کند، سلول‌ها را قادر به تقسیم می‌کند و مواد زائد را پاکسازی می‌کند. اما ما دقیقاً نمی‌دانیم که چگونه همه این کارها را انجام می‌دهد.

ما یک چیز را مطمئن می‌دانیم: هانتینگتین یک دوست صمیمی به نام HAP40 دارد، یک پروتئین کوچکتر که به آن می‌چسبد و به عنوان یک شریک اتصالاتصال برش دادن پیام های RNA، برای حذف مناطق غیر کدکننده و اتصال به مناطق کد کننده. شناخته می‌شود. تا کنون، HAP40 تنها شریک اتصالی بوده که دانشمندان تصویر ساختاری دقیقی از آن داشته‌اند. محدودیت در شناسایی سایر کارهای هانتینگتین و با چه کسی، به دلیل کمبود ابزارهای دقیق و خاص برای به دام انداختن آن بوده است.

ساخت قلاب‌های مولکولی

برای ساخت ابزارهای بهتر، دانشمندان از یک سیستم هوشمند به نام RaPID استفاده کردند. RaPID را به عنوان یک مهمانی بزرگ «سرعت-آشنایی» بین پپتیدهای کوچک (قطعات کوچک پروتئین) و هانتینگتین در نظر بگیرید. این تیم مجموعه‌ای فوق‌العاده بزرگ از حدود یک تریلیون پپتید کوچک مختلف ساخت – یعنی ۱ و ۱۲ صفر بعد از آن!

هر پپتید به صورت یک حلقه بسته خم شده بود، چیزی شبیه به یک کش لاستیکی. یک شکل حلقوی یا تاخورده می‌تواند راحت‌تر به چیزها بچسبد تا یک رشته مستقیم، درست مانند یک گیره کاغذ خم شده که می‌تواند به اشیاء قلاب شود، در حالی که یک سیم صاف فقط از کنار آنها می‌لغزد.

هر حلقه پپتیدی کوچک برچسب نام خود (ساخته شده از DNA) را به خود متصل داشت. بنابراین وقتی یک حلقه به هانتینگتین متصل می‌شد، دانشمندان می‌توانستند برچسب آن را بخوانند و دقیقاً بدانند کدام پپتید است. آنها چندین دور «ماهیگیری» انجام دادند تا مجموعه پپتیدهای حلقوی را در معرض هانتینگتین قرار دهند، چه به تنهایی و چه متصل به دوستش HAP40. آنها مجموعه را به چسبنده‌ترین‌ها محدود کردند و پنج پپتید حلقوی به عنوان بهترین متصل‌شونده‌های هانتینگتین ظاهر شدند: HL2، HL5، HD4، HHL1 و HHD3.

دیدن دقیق محل اتصالاتصال برش دادن پیام های RNA، برای حذف مناطق غیر کدکننده و اتصال به مناطق کد کننده. هر حلقه پپتیدی

یافتن حلقه‌های پپتیدی که به هانتینگتین می‌چسبند تنها گام اول است. در مرحله بعد، دانشمندان می‌خواستند بدانند هر کدام در کجا به هانتینگتین متصل می‌شوند و با چه شدتی. آنها از سه روش جالب برای کشف این موضوع استفاده کردند:

• آزمایش‌هایی که قدرت نگهداری حلقه‌ها را اندازه‌گیری می‌کنند. هر پنج حلقه واقعاً محکم نگه داشته شدند، به اندازه‌ای قوی که ابزارهای مفیدی باشند، و حتی شاید نقطه شروعی برای داروهای بالقوه‌ای که بتوانند هانتینگتین سمی را از بین ببرند.
• روشی به نام HDX-MS که نشان می‌دهد کدام قسمت‌های یک پروتئین هنگام اتصالاتصال برش دادن پیام های RNA، برای حذف مناطق غیر کدکننده و اتصال به مناطق کد کننده. یک حلقه به آن پوشانده می‌شوند. وقتی یک حلقه به هانتینگتین متصل می‌شود، نقاط خاصی را محافظت می‌کند و یک «ردپا» باقی می‌گذارد که به دانشمندان کمک می‌کند تا محل فرود حلقه را بفهمند.
• میکروسکوپ کریو-الکترونی (cryo-EM)، که یک میکروسکوپ فوق‌العاده قدرتمند است که پروتئین‌ها را منجمد می‌کند و تصاویر سه‌بعدی را با وضوح بالا ایجاد می‌کند که می‌توانید اتم‌های منفرد را ببینید. (بله، به همان اندازه که به نظر می‌رسد جالب است.) این روش تماس‌های دقیق هر پپتید با پروتئین هانتینگتینپروتئین هانتینگتین پروتئین تولید شده توسط ژن هانتینگتون را نشان داد.

آنچه آنها یافتند: دو حلقه (HL2 و HD4) هانتینگتین را در نقاطی دور از دوست صمیمی‌اش HAP40 به دام می‌اندازند.

دو حلقه دیگر (HHL1 و HHD3) تنها زمانی کار می‌کنند که HAP40 حضور داشته باشد، و در یک جیب کوچک درست بین دو دوست فشرده می‌شوند و خود را به شکلی شبیه عدد ۸ تا می‌کنند تا جا شوند.

آخرین حلقه (HL5) تنها زمانی هانتینگتین را دوست دارد که تنها باشد، بدون HAP40.

و این یک نکته مهم است: پنج حلقه، هانتینگتین سالم و هانتینگتین گسترش‌یافته را به همان خوبی به دام انداختند، که به ویژه در ابزاری که برای مطالعه پروتئین در سلول‌های سالم و بیمار طراحی شده است، مفید است.

ماهیگیری برای دوستان هانتینگتین در سلول‌های واقعی

ابزارهای مفید باید در زندگی واقعی کار کنند، نه فقط در لوله‌های آزمایش. بنابراین دانشمندان یک قلاب کوچک (به نام بیوتین) را به حلقه‌های پپتیدی خود اضافه کردند، مانند یک قلاب ماهیگیری روی نخ. دانشمندان از این پپتیدها به عنوان طعمه استفاده کردند تا ببینند آیا می‌توانند هانتینگتین را در سلول‌های انسانی کشت شده در ظروف، همراه با هر چیز دیگری که به آن چسبیده بود، صید کنند.

یک دوست هانتینگتین بسیار برجسته‌تر از بقیه بود – HAP40. این پروتئین بارها و بارها، در هر نوع سلولی که دانشمندان امتحان کردند، از جمله سلول‌های شبه مغزی که شبیه به سلول‌های آسیب‌دیده در HD هستند، ظاهر شد. حتی در سلول‌هایی با تکرارهای CAG طولانی‌تر (مانند Q45 یا Q81)، هانتینگتین همیشه HAP40 را به خود چسبیده داشت.

گزارش شده است که بیش از ۳۰۰۰ پروتئین دیگر با هانتینگتین در تماس هستند، اما این آزمایش نشان می‌دهد که HAP40 تنها پروتئینی است که همیشه در آنجا حضور دارد. این به شدت نشان می‌دهد که هانتینگتین و HAP40 بیشتر اوقات به عنوان یک واحد عمل می‌کنند، و شکل «واقعی» هانتینگتین در داخل سلول‌ها تقریباً همیشه جفت هانتینگتین-HAP40 است.

چرا این موضوع برای بیماری هانتینگتون اهمیت دارد

این حلقه‌های جدید هنوز دارو نیستند، و دانشمندان مراقبند که چنین ادعایی نکنند. اما آنها درهای هیجان‌انگیز زیادی را باز می‌کنند.

اولاً، آنها به همان خوبی ابزارهای قبلی دانشمندان برای اتصالاتصال برش دادن پیام های RNA، برای حذف مناطق غیر کدکننده و اتصال به مناطق کد کننده. و تجسم هانتینگتین (به نام آنتی‌بادی‌ها) کار می‌کنند، اما کوچکتر، ارزان‌تر هستند و می‌توانند به بسیاری از قسمت‌های مختلف هانتینگتین متصل شوند، نه فقط یک قسمت. آنها همچنین به اندازه‌ای کوچک هستند که ممکن است بتوانند به داخل سلول‌های زنده نفوذ کرده و به هانتینگتین متصل شوند، کاری که آنتی‌بادی‌های فعلی نمی‌توانند انجام دهند. این به دانشمندان اجازه می‌دهد تا هانتینگتین را در داخل سلول‌های زنده به روش‌هایی مطالعه کنند که در حال حاضر غیرممکن است.

ثانیاً، تصاویر سه‌بعدی با وضوح بالا از اتصالاتصال برش دادن پیام های RNA، برای حذف مناطق غیر کدکننده و اتصال به مناطق کد کننده. این حلقه‌های پپتیدی به هانتینگتین، مانند نقشه‌هایی برای طراحی داروهای آینده هستند. به عنوان مثال، شکل ۸ دو جیب کوچک را در نقطه اتصالاتصال برش دادن پیام های RNA، برای حذف مناطق غیر کدکننده و اتصال به مناطق کد کننده. هانتینگتین-HAP40 نشان می‌دهد که داروهای آینده می‌توانند آن را هدف قرار دهند، احتمالاً برای «ماهیگیری» هانتینگتین سمی. این حلقه‌ها همچنین ممکن است به عنوان بخش «گیرندهگیرنده مولکولی روی سطح سلول که مواد شیمیایی سیگنال دهنده به آن متصل می شوند» ابزارهای جدید و جالبی مانند PROTACs (ابزارهایی که به سلول می‌گویند هانتینگتین را دور بریزد) یا ردیاب‌های PET که می‌توانند به پزشکان در تجسم هانتینگتین در مغز بیماران کمک کنند، استفاده شوند.

ثالثاً، این واقعیت که هانتینگتین تقریباً همیشه با HAP40 در داخل سلول‌ها است، نحوه رویکرد ما به آن را بازتعریف می‌کند. اگر می‌خواهیم بفهمیم هانتینگتین چه کاری انجام می‌دهد، یا چگونه آن را زمانی که تغییر می‌کند و سمی می‌شود، اصلاح کنیم، احتمالاً باید آن را با HAP40 مطالعه کنیم، نه به تنهایی. دانشمندان اکنون مجموعه ابزارهای دقیق‌تری برای بررسی این راز دارند که آیا هانتینگتین می‌تواند بدون HAP40 عمل کند یا خیر.

نگاهی به آینده

مانند همه علوم، این مقاله نیز سوالات زیادی را بی‌پاسخ می‌گذارد. حلقه‌ها هانتینگتین سالم و HD را به یک شکل به دام می‌اندازند، بنابراین هنوز نمی‌توانند به ما بگویند چگونه فقط نوع مضر را هدف قرار دهیم، که این چیزی است که محققان هنوز روی آن کار می‌کنند.

گام‌های بعدی آزمایش آنها در داخل حیوانات زنده و بازطراحی آنها برای نفوذ به سلول‌ها خواهد بود. برخی از شرکای اتصالاتصال برش دادن پیام های RNA، برای حذف مناطق غیر کدکننده و اتصال به مناطق کد کننده. احتمالی جدید هانتینگتین نیز یافت شدند، مانند ACADVL و HEY1، که برای تأیید آنها آزمایش‌های بیشتری لازم است.

این تحقیق مجموعه ابزارهای کاملاً جدیدی را برای جامعه HD فراهم می‌کند، برای پروتئینی که به دام انداختن آن واقعاً دشوار بوده است. درست همانطور که میکروسکوپ‌های شگفت‌انگیز آنچه دانشمندان می‌توانستند ببینند را تغییر دادند، این حلقه‌های پپتیدی کوچک نوید می‌دهند که آنچه را که می‌توانیم در مورد عملکرد هانتینگتین، در سلامتی، در بیماری و در جستجوی درمان بپرسیم، متحول کنند.

خلاصه

• بیماری هانتینگتون (HD) ناشی از تغییری است که پروتئین هانتینگتینپروتئین هانتینگتین پروتئین تولید شده توسط ژن هانتینگتون را به طور غیرطبیعی بلند می‌کند. دانشمندان هنوز به طور کامل نمی‌دانند این پروتئین چه کاری انجام می‌دهد، زیرا بسیار بزرگ است و مطالعه آن با ابزارهای موجود دشوار است.
• با استفاده از سیستمی به نام RaPID، این تیم حدود یک تریلیون قطعه پروتئینی کوچک حلقوی را آزمایش کرد و پنج مورد را شناسایی کرد که به طور محکم و خاص به هانتینگتین متصل می‌شوند، هر کدام در یک نقطه متفاوت و کاملاً مشخص.
• یک میکروسکوپ با وضوح بالا دقیقاً نشان داد که چگونه حلقه‌ها به هانتینگتین متصل می‌شوند. دو مورد از آنها حتی به شکل یک عدد ۸ جالب تا می‌شوند تا در جیبی بین هانتینگتین و دوست صمیمی‌اش HAP40 جا شوند.
• هنگامی که از حلقه‌ها برای «ماهیگیری» هانتینگتین از سلول‌های انسانی واقعی استفاده شد، تقریباً همیشه HAP40 را همراه با آن صید کردند، صرف نظر از نوع سلول یا طول تکرار CAGتکرار CAG کشش DNA در ابتدای ژن هانتینگتون که حاوی توالی CAG است که بارها تکرار شده است و در افرادی که به هانتینگتون مبتلا می شوند به طور غیر طبیعی طولانی است..
• این حلقه‌ها نسبتاً ارزان، کوچک و انعطاف‌پذیر هستند، بنابراین می‌توانند به ایجاد داروهای آینده HD، ابزارهای تصویربرداری مغز و روش‌های جدید برای از بین بردن هانتینگتین مضر کمک کنند.